Năm 17 tuổi anh bắt đầu chơi cho đội hình B Barca. Dưới thời huấn luyện viên Louis van Gaal anh được đưa lên đội hình A. Ngày 2 tháng 10 năm 1999 anh chơi trận đấu đầu tiên cho đội một Barca trong chiến thắng 2-0 trước Valladolid.

Tháng 9 năm 2005 anh gia hạn hợp đồng chơi cho Barca đến năm 2010. Trong điều khoản hợp đồng này có quy định phí hủy hợp đồng lên đến 150 triệu euro. Theo đó thì tuyển thủ Tây Ban Nha này cùng với Ronaldinho, Deco, Xavi, Samuel Eto'o và Lionel Messi sẽ gắn bó lâu dài với đội bóng xứ Catalan.

World Cup 2010 là giải đấu thành công với Tây Ban Nha nói chung và cá nhân Puyol nói riêng. Với lối chơi quyết liệt và thông minh anh đã giúp Tây Ban Nha lập kỷ lục là một trong 2 đội bóng để lọt lưới ít nhất tại một kỳ World Cup (2 bàn thua) và có bàn thắng quyết định trong trận bán kết với Đức đưa Tây Ban Nha vào trận chung kết tiếp và vô địch.